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실험의 원리

대장균의 형질전환 세균은 세균 밖에 존재하는 DNA를 자기 스스로 세포 안으로 끌어들여서 자신의 형질을 변화시키는 성질들이 있다. 이런 형질의 변화를 형질전환이라 하며 폐렴균, 고초균, 인플루엔자군, 등에서 관찰 된다. 이들 세균은 자연적으로 형질전환을 일으킬 수 있으나 대장균은 자연적으로 형질전환을 할 수 없어서 인위적으로 염화칼슘 처리를 해야만 세포 밖의 DNA가 세포 안으로 확산되어 들어갈 수 있다. 이처럼 세균에 물리적 또는 화학적 처리를 하여 세균이 DNA를 받아들일수 있게 처리되었을 때 이를 수용성(competent)이라 한다. 형질전환 실험에서는 플라스미드라 하는 특이한 DNA분자를 E.coil에 도입한다. 플라스미드란 여러 세균에서 발견되는 작은 원형의 DNA 분자이며 모든 플라스미드는 복제 시작점(origin of replication) 역할을 하는 DNA 염기 배열을 적어도 하나는 가지고 있기 때문에 세균의 염색체와는 별도로 세포 내에서 다량 복제한다는 특성이 있다. 플라스미드는 어떤 항생제에 내성을 갖게 하는 단백질을 암호화한 유전자를 하나 이상 갖고 있므여, E.coil 유래의 유전자 뿐만 아니라 다른 생물체로부터 유래한 유전자도 이 플라스미드에 삽입함으로써 필요한 유전자를 갖는 새로운 플라스미드를 만들어 낼 수있다. 한 편, E.coil 박테리아를 DNA를 받아들일 수 있는 상태인 competent cell로 만들기 위해서는 먼저 E.coil를 액체배지에 접종하여 Log phase까지 배양해야 한다. 세균을 일정조건 하에서 배양하면서 배양액 중의 균주를 계산하여 그래프 상에 나타난 것을 증식곡선이라 한다. 이 곡선은 지체기 또는 유도기 (log phase), 지수기 또는 대수기 (log phase, exponential phase), 정지기 또는 정상기 (stationary phase) 및 사멸기의 네 가지로 구분한다. 세균의 수가 증가함에 따라 배양액 중의 흡광도가 증가하므로, 세균을 배양하면서 흡광도를 측정하면 세균이 어느 정도 증식했는지 알 수 있다. 세균의 증식 곡선 중에서 세균이 외부로부터 DNA를 받아들이기 가장 쉬운 시기가 log phase인데 그 이유는 log phase에서는 세균 표면에 DNA를 받아들일 수 있는 수용체가 가장 많이 생성되어 있기 때문이다. E.coil strain 중에서 형질전환에 쓰이는 competent cell을 만드는 데 가장 많이 쓰이는 strain은 DH5-a 인데 이 균주를 액체배지에 접종하고 log phase에서 배양을 멈춘 후 이 배양액을 원심분리하여 calcium chloride용액에 다시 잘 섞는다.


Transformation의 개념

Transformation(형질전환)이란 DNA를 bacteria 세포 내로 주입하는 과정을 말합니다.

Prokaryote와 eukaryote에서는 DNA를 세포 내로 주입할 때 다음과 같이 조금 다른 용어를 사용합니다. 이 실험에서는 prokaryote인 E.coli를 사용하므로 'transformation'을 하는 것입니다.

Cell DNA Term

Prokaryote Plasmid
Bacteriophage (virus)
Transformation
Infection
Eukaryote Plasmid
Virus vector
Transfection
Transfection


참고로 eukaryote에서 DNA를 세포 내로 주입하는 transfaction 방법에는 다음과 같은 것들이 있습니다. 각자 장단점이 있습니다.

Chemical method
    - Calcium phosphate를 이용한 방법
    - Liposome을 이용한 방법
Physical method
    - Electroporation
    - Microinjection
Virus를 이용한 방법
    - Retrovirus
    - Adeno or adenoassociate virus

Competent cell 이란?

Competent cell이란 정상적인 bacteria에 화학적 처리를 하여 DNA가 잘 들어갈 수 있게 만든 cell을 의미합니다. 화학처리에 쓰이는 시약은 다음과 같이 여러가지가 있으며 이 중 가장 중요한 것은 calcium chloride입니다.

  • Calcium Chloride
  • Manganase Chloride
  • Hexamminecobalt Chloride
  • Dimethyl Sulfoxide (DMSO)

Competent cell을 이용한 transformation의 과정은 다음 모식도와 같습니다. CaCl2로 처리하여 competent cell로 만들면 plasmid가 cell에 들어갈 수 있게 됩니다. Heat shock을 가하면 plasmid 가 cell 안으로 들어가는 효율을 증가시킬 수 있습니다. 이제 이 과정을 차례차례 사진과 함께 설명하겠습니다.

Competent cell 의 제조방법

Calcium chloride를 이용한 competent cell의 대표적인 제조방법은 다음과 같습니다.

  1. LB plate에 자란 DH5 alpha colony를 LB 배지 2 ml에 접종한 후 밤새 키웁니다.
  2. 위에서 키운 배양액 1 ml을 100 ml LB 배지가 담긴 플라스크에 넣고 O.D.600이 0.4가 될 때까지 37°C shaking incubator에서 키웁니다.
  3. 배양액을 50 ml conical tube에 넣고 얼음에 10분간 놓아둡니다.
  4. 4°C에서 4,500 rpm으로 10분간 원심분리합니다.
  5. 상층액을 완전히 제거한 후 미리 차게 해 둔 0.1 M filtered CaCl2 용액을 원래의 1/2 부피로 넣고 부유시킵니다.
  6. 얼음에 15분 놓아두었다가 다시 4°C에서 3,000∼4,000 rpm으로 10분간 원심분리합니다.
  7. 상층액을 버리고 처음의 1/10 부피의 filtered CaCl2 용액으로 부유시킵니다.
  8. 얼음에 30분 놓아두었다가 미리 차게 해둔 microfuge tube에 200 ul씩 분주하고, 사용할 때까지 deep freezer에 보관합니다.

위 방법은 사실 가장 간단한 방법으로, 최근에는 잘 쓰지 않습니다. Transformation의 효율을 높이기 위하여 사람들이 여러 방법을 modify해서 쓰고 있는데, 예를 들어 어떤 물질을 첨가한다든지, 균을 낮은 온도에서 키운다든지 하는 방법입니다.

효율이 더 높은 방법을 원하시면 이 홈페이지의 워크샵 교본 [박테리아의 형질전환] 편을 참고하시기 바랍니다.

Competent cell은 사진에서처럼 -70°C 냉동고 속에 보관하다가 필요할 때마다 꺼내어 씁니다. Gene cloning의 필수 요소인 competent cell 정도는 남에게 얻어 쓰지 말고 스스로 만들어서 쓰는 게 좋겠습니다.

Transformation 과정

Transformation은 비교적 간단합니다. Competent cell을 하나 꺼내어 녹인 다음, 준비해 왔던 DNA ligate를 섞어서 얼음에 30분 두고, 이어 42°C에서 90초간 heat shock을 준 다음에 배지에 깔면 되는 것입니다.

균 용액을 이제 항생제가 포함된 고체 LB 배지에 얇게 펴서 바릅니다.

간단하지요? 그러나 지금부터 어려워집니다. 위와 같은 기본 실험 방법에서 고려되고 있는 몇가지 사항이 있거든요. 그것이 바로 selection의 개념입니다.


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